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鹽析法純化免疫球蛋白原理、步驟及注意事項

發(fā)布時間:2023/7/10點擊次數(shù):1946

原理

蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度,以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當(dāng)用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液,中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì),于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時,中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后,由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變,蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和,更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低,使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。

材料與儀器

血清
生理鹽水 硫酸銨溶液 萘氏試劑 磷酸鹽緩沖鹽液 磺基水楊酸
冰箱 離心機(jī) 攪拌器 紫外分光光度計 扭力天平 粗天平 透析袋 尼龍繩 竹棒、PH試紙 鑷子 剪刀 燒杯 量筒 吸管 滴管 滅菌小瓶 試管

步驟

1. 取正常人混合血清加等量生理鹽水,于攪拌下逐滴加入與稀釋血清等量的飽和硫酸銨[終濃度為50 %飽和(NH4)2SO4],4 ℃,3 小時以上,使其充分沉淀

2. 離心(3000 rpm), 20 分鐘,棄上清,以生理鹽水溶解沉淀至X ml。再逐滴加飽和硫酸銨X/2 ml,置4 ℃,3 小時以上[此時(NH4)2SO4的飽和度為33 %)]


3. 重復(fù)上述第二步過程多次。將末次離心后所得沉淀物以0.02 M PH7.4 PBS溶解至X ml裝入透析袋。對PBS充分透析、除鹽換液3次,至萘氏試劑測透析外液為無黃色

4. 將透析袋內(nèi)樣品取少許作適當(dāng)倍數(shù)稀釋后,以751-G紫外分光光計測蛋白含量。


方法如下

蛋白含量(mg/ml)=(1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm)×樣品稀釋度。

注:式中1.45與0.74為常數(shù),nm為波長。

注意事項

一、影響鹽析的因素

1. 蛋白質(zhì)的濃度

鹽析時,溶液中蛋白質(zhì)的濃度對沉淀有雙重影響,既可影響蛋白質(zhì)沉淀極限,又可影響蛋白質(zhì)的共沉作用。蛋白質(zhì)濃度愈高,所需鹽的飽和度極限愈低,但雜蛋白的共沉作用也隨之增加,從而影響蛋白質(zhì)的純化。故常將血清以生理鹽水作對倍稀釋后再鹽析。

2. 離子強(qiáng)度

各種蛋白質(zhì)的沉淀要求不同的離子強(qiáng)度。例如當(dāng)硫酸銨飽和度不同,析出的成分就不同,飽和度為50 %時,少量白蛋白及大多數(shù)擬球蛋白析出;飽和度為33 %時γ球蛋白析出。

3. 鹽的性質(zhì)

較為有效的鹽是多電荷陰離子。

4. PH值

一般說來,蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多,它的溶解度越大。改變PH改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì),也就改變了蛋白質(zhì)的溶解度。


5. 溫度

鹽析時溫度要求并不嚴(yán)格,一般可在室溫下操作。血清蛋白于25 ℃時較0 ℃更易析出。但對溫度敏感的蛋白質(zhì),則應(yīng)于低溫下鹽析。

6. 蛋白質(zhì)沉淀后宜在4 ℃放3 小時以上或過夜,以形成較大沉淀而易于分離。

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