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內(nèi)溶素的克隆、誘導(dǎo)表達(dá)與純化

發(fā)布時(shí)間:2023/7/12點(diǎn)擊次數(shù):1935

簡(jiǎn)介

作為噬菌體衍生的酶,內(nèi)溶素本質(zhì)是一種蛋白分子,其通過(guò)分解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖成分,幫助噬菌體顆粒從細(xì)菌宿主釋放,可在噬菌體復(fù)制過(guò)程中表達(dá),破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的關(guān)鍵化學(xué)鍵。

原理

通過(guò)內(nèi)溶素的蛋白表達(dá)、純化能夠?qū)?nèi)溶素基因克隆到表達(dá)載體(如 pET28a),進(jìn)一步轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增,重組質(zhì)粒經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表達(dá),得到經(jīng)鎳柱純化的內(nèi)溶素蛋白。

用途

為治療抗生素耐藥的細(xì)菌感染提供潛在解決方案。

材料與儀器

儀器:

離心機(jī)、超聲破碎儀

恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、PCR 儀、電泳儀

凝膠掃描儀、鎳柱純化系統(tǒng)、0.22 μm 濾膜

試劑:

質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒

核酸內(nèi)切酶、T4 連接酶、Pfu 聚合酶

IPTG、考馬斯亮藍(lán)

步驟

1)內(nèi)溶素的克隆

1、引物設(shè)計(jì):對(duì)待研究的內(nèi)溶素完成基因組測(cè)序注釋工作,根據(jù)已測(cè)基因組進(jìn)行引物設(shè)計(jì) P1 P2,并引入酶切位點(diǎn)。

2、PCR 擴(kuò)增內(nèi)溶素基因:反應(yīng)體系與程序見(jiàn)表 1。

image.png

3PCR 反應(yīng)條件:95 ℃ 預(yù)變性 5 min,95 ℃ 變性 30 sTm 溫度下退火30 s,72 ℃ 延伸 30 s,共 30 個(gè)循環(huán),72 ℃ 最后延伸 10 min26 ℃ 再反應(yīng) 2 min(終止反應(yīng))。

4、回收 PCR 產(chǎn)物膠:進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,將 50 μL 全部上樣,切下目的基因條帶,使用膠回收試劑盒回收目的基因(一般實(shí)驗(yàn)室都會(huì)有常用品牌)。

5、抽提質(zhì)粒:使用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提載體質(zhì)粒(一般實(shí)驗(yàn)室都會(huì)有常用品牌)。

6、對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行酶切:利用一開(kāi)始設(shè)計(jì)好的酶切位點(diǎn)對(duì)載體與目的基因進(jìn)行雙酶切,在 37 ℃ 下反應(yīng) 3 h。

7、切膠回收:將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,切取含 DNA 片段的目的條帶并進(jìn)行回收,得到 DNA 后檢測(cè)其濃度并保存在 -20 ℃ 冰箱備用。

8、DNA 與載體連接:用 T4 連接酶連接載體與 DNA 片段,在 16 ℃ 下過(guò)夜。

9、轉(zhuǎn)化大腸桿菌:取 50 μL 大腸桿菌 BL21 感受態(tài)細(xì)胞,加入 5 μL 連接液后冰上孵育 30 min,搖勻后 42 ℃ 水浴熱休克 90 s,然后迅速冰浴 2 min,冰浴后再加入已經(jīng)預(yù)熱的 1 mL LB 培養(yǎng)基,37 ℃ 搖床震蕩 1 h 復(fù)蘇,最后涂板至卡那霉素抗性的平板,37 ℃ 溫度下培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑取單菌落進(jìn)行菌落 PCR,將陽(yáng)性菌落接種于培養(yǎng)基中 37 ℃ 溫度下培養(yǎng)過(guò)夜。

10、抽提質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證(參見(jiàn) 5、6 步)。

2)內(nèi)溶素的表達(dá)與純化

1、少量誘導(dǎo)表達(dá):挑選單菌落過(guò)夜培養(yǎng),過(guò)夜菌接種至 1 mL 培養(yǎng)基,37 ℃ 培養(yǎng) 2~3 h,再加入 10 μL 0.1 M IPTG 16 ℃ 誘導(dǎo) 4 h,取 20 μL 菌液加入 7.5 μL 的蛋白緩沖上樣液,100 ℃ 沸水煮 10 min 后電泳,倒入考馬斯亮藍(lán)過(guò)夜震蕩,清洗后尋找發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白條帶存在,進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。

2、擴(kuò)大培養(yǎng):將陽(yáng)性菌落涂布平板過(guò)夜,挑選單菌落接種至 10 mL 培養(yǎng)基,37 ℃ 培養(yǎng) 6 h,按  1:100 比例接種于 500 mL 培養(yǎng)液中,37 ℃ 搖床至 OD600 值為 0.6~0.8,加入終濃度為 1 mM IPTG 誘導(dǎo)劑,在 16 ℃ 下繼續(xù)培養(yǎng) 12 h。

3、細(xì)胞破碎:菌液離心 10 min4000 g4 ℃),重懸于 30 mL PBS,加入 PMSF tritonX-100 冰浴 1 h 后超聲破碎,破碎菌液在 4 ℃ 轉(zhuǎn)入 50 mL 離心管,12000 rpm 離心10 min,取上清液用 0.22 μm 濾膜過(guò)濾雜質(zhì)。

4、蛋白純化:采用 Ni-NTA 純化系統(tǒng)進(jìn)行鎳柱親和層析純化目的蛋白,純化后跑電泳,分析蛋白純度。

注意事項(xiàng)

1. PCR 條件與程序需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行梯度摸索。

2. T4 連接酶在高溫不穩(wěn)定,通常 16 ℃ 連接過(guò)夜,在 25 ℃ 左右的室溫能維持七八個(gè)小時(shí)。

常見(jiàn)問(wèn)題

蛋白誘導(dǎo)表達(dá)效果不好(蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件并不一定適用所有實(shí)驗(yàn)室,需要自己做實(shí)驗(yàn)摸索條件)。

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